ДИАГНОСТИКА МЕТОДОМ ПЦР

Полимеразная цепная реакция – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий выявить различные инфекционные и наследственные заболевания.

Для большинства инфекций ПЦР–диагностика стала своеобразным «золотым стандартом».

ПЦР – диагностика это:

• непосредственное выявление присутствия возбудителя в исследуемом образце;
•   высокая специфичность, позволяющая определять уникальный участок ДНК или РНК;
•   высокая чувствительность метода позволяющая обнаружить даже единичные клетки возбудителя (вирусов, бактерий);
•   методика позволяет выделить несколько возбудителей из одной пробы;
•   возможность обнаружения патогенов до возникновения симптомов заболевания (доклиническая диагностика) и после прошедшей болезни (ретроспективная диагностика).

Каждый живой организм имеет свои уникальные гены, содержащиеся  в молекуле ДНК, которая и является «визитной карточкой» каждого конкретного организма. Молекула ДНК – очень длинная молекула, состоящая из «кирпичиков» - нуклеотидов, расположены нуклеотиды у каждого организма  строго специфично, в определенной последовательности и комбинации.

В биологическом материале, забираемом на исследование, генетического материала мало и невозможно сказать какому организму он принадлежит. Для решения этой задачи и служит ПЦР-диагностика.

Основой метода является многократное удвоение (амплификация) определенного участка ДНК или РНК возбудителя при помощи ферментов. В результате образуется количество ДНК или РНК достаточное для исследования. Копируется только тот участок, который подходит под заданные параметры.

Какие инфекции можно выявить методом ПЦР:

•   ВИЧ
•   вирусные гепатиты
•   инфекционный мононуклеоз (ДНК вируса Эпштейна-Барр)
•   цитомегаловирусная инфекция
•   герпетическая инфекция
•   ИППП
•   туберкулез
•   онкогенные вирусы
•   Боррелиоз
•   листериоз
•   кандидоз
•   хеликобактерная  инфекция и др.
•   бактерии

Результат лабораторной диагностики методом ПЦР, как и любым другим лабораторным методом, во многом зависит от забора клинического материала, условий его хранения и транспортировки.

Материалом для ПЦР-исследования могут служить различные биологические среды и жидкости:

•   при обследовании на инфекции (ВИЧ, гепатиты, герпетич.инфекц., ЦМВ, мононуклеоз, токсоплазмоз и др.) – кровь
•   для диагностики мононуклеоза можно брать мазок из зева
•   в пульмонологическом отделении – мокрота, плевральнаяжидкость
•   в неврологическом отделении - СМЖ

КЛИНИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ МУЖЧИН

Тип клинического материала	Диагностическая задача	Выявляемые микроорганизмы
ü  Соскоб эпителиальных клеток из уретры, отделяемое уретры ü  соскобное отделяемое крайней плоти головки полового члена ü  моча	Скрининг на ИППП, этиологическая диагностика уретрита, мониторинг а/б терапии уретрита Диагностика баланопостита Скрининг на ИППП, этиологическая диагностика уретрита	ИППП: Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Mycoplasma genitalium Trichomonas vaginalis УПМ                        Mycoplasma hominis Ureaplasma spp Streptococcus spp Staphylococcus spp Candida spp и др.
Соскобное отделяемое эрозивно-язвенных элементов	Дифференциальная диагностика инфекций, вызывающих эрозивно-язвенные поражения	Treponema pallidum, HSV I /II
Соскоб эпителия с новообразований головки полового члена, перинатальной области	Дифференциальная диагностика инфекций, вызывающих кондиломатозные образования	ВПЧ низкого онкогенного риска
Секрет предстательной железы	Этиологическая диагностика бактериального простатита	ИППП: Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Mycoplasma genitalium Trichomonas vaginalis УПМ                        Mycoplasma hominis Ureaplasma spp Streptococcus spp Staphylococcus spp Candida spp и др.

 

Для диагностики урогенитальных инфекций у мужчин исследуют соскобное отделяемое уретры, первую порцию мочи, секрет предстательной железы и/или эякулят.

•   в большинстве случаев диагностики острого уретрита или при обострениях хронического уретрита исследуют отделяемое передней уретры;
•   при хронических, малосимптомных воспалительных процессах, при простатите дополнительно исследуют секрет предстательной жедезы или превую порцию мочи после массажа простаты;
•   при диагностике мужского бесплодия дополнительно исследуют эякулят
•   при скрининговых исследованиях на ИППП целесообразно использовать первую порцию мочи как материал, полусаемый неинвазивным путем

ВЗЯТИЕ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Соскобное отделяемое уретры – в большинстве случаев при диагностике урогенитальных инфекций материалом для исследования является соскобное отделяемое передней уретры.

Перед взятием соскоба обрабатывают головку полового члена в области наружного отверстия уретры стерильным физиологическим раствором.

Моча (первая порция)

Для анализа используют первую порцию утренней мочи, собранной в количестве 15-25 мл в специальный сухой стерильный контейнер.

Первая порция мочи является адекватным альтернативным материалом соскобу эпителиальных клеток уретры при диагностике ИППП у мужчин, к тому же получаемым неинвазивным путем.

Секрет предстательной железы и/или эякулят                                                     

Для диагностики инфекций верхних отделов органов репродукции исследуют секрет предстательной железы и/или эякулят. Перед получением секрета простаты головку полового члена обрабатывают стерильным ватным тампоном.

Секрет простаты забирают после предварительного массажа простаты через прямую кишку. После окончания массажа – ее секрет собирают в сухой стерильный контейнер.

КЛИНИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ЖЕНЩИН

Тип клинического материала	Диагностическая задача	Выявляемые микроорганизмы
Соскоб эпителия слизистой цервикального канала	Цервикальный скрининг с использованием ВПЧ-теста	ВПЧ высокого онкогенного риска
	Этиологическая диагностика цервицита, эндометрита. Мониторинг а/б терапии цервицита, эндометрита.	ИППП: Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Mycoplasma genitalium Trichomonas vaginalis УПМ                        Mycoplasma hominis Ureaplasma spp Streptococcus spp Staphylococcus spp Candida spp и др.
Соскобное отделяемое эрозивно-язвенных элементов	Дифференциальная диагностика инфекций, вызывающих эрозивно-язвенные поражения	Treponema pallidum, HSV I /II
Соскоб эпителия с кондиломатозных образований	Дифференциальная диагностика инфекций, вызывающих кондиломатозные образования	ВПЧ низкого онкогенного риска
Отделяемое влагалища или мазок из влагалища	Скрининг на ВПЧ высокого онкогенного риска (для женщин старше 25-30 лет)	ИППП: Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Mycoplasma genitalium Trichomonas vaginalis УПМ Garnerella vaginalis Atopobium vaginae           Mycoplasma hominis Ureaplasma spp E.coli Streptococcus spp Staphylococcus spp Candida spp и др.
	Скрининг на ИППП
	Дифференциальная диагностика синдрома патологических выделений из влагалища
Моча	Дифференциальная диагностика уретрита, цистита	ИППП: Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Mycoplasma genitalium Trichomonas vaginalis

ВЗЯТИЕ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Соскоб эпителия слизистой цервикального канала

Используется для диагностики всех форм инфекций, вызванных Chlamydiatrachomatis, Neisseragonorrhoeae, Humanpapillomavirus, Mycoplasmagenitalium, HSV1,2, CMV. Исследование материала обязательно при проведении контроля лечения указанных инфекций. Клинический материал из цервикального канала должен содержать достаточное количество клеток цилиндрического эпителия.

ПЕРЕНОС КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

После получения клинического материала инструмент с материалом переносится в пробирки с транспортной средой. Рабочую часть зонда, содержащую материал, обламывают в области насечки и оставляют в пробирке с транспортной средой. В случае отсутствия насечки погружают рабочую часть зонда в среду и, прижав ее к внутренней стенке пробирки, вращают зонд 5-10 секунд, после чего инструмент удаляют, а пробирку плотно закрывают. Недопустимо использование ножниц для обрезания рабочей части зонда!

Преимущества оставления зонда с клиническим материалом в пробирке с транспортной средой:

•   более полное и эффективное смывание вязкого клинического материала с поверхности зонда, обеспечивающее попадание даже единичных микроорганизмов в ПЦР-исследование;
•   для последующего ПЦР-исследования используется аликвота, а оставшаяся часть материала может быть использована для дальнейших исследований или повторных анализов.

ОТДЕЛЯЕМОЕ КОНЪЮКТИВЫ

•   материал забирается утром, до умывания с внутренней поверхности нижнего века
•   необходимо следить, чтобы при моргании ресницы не касались тампона
•   при скудном отделяемом тампон предварительно смачивают стерильным физиологическим раствором или стерильной дистиллированной водой. Избыток влаги отжимают о внутреннюю поверхность емкости

ОСОБЕНОСТИ ВЗЯТИЯ МОКРОТЫ

•   исследованию подлежит утренняя мокрота, выделяющаяся во время приступа кашля
•   перед откашливанием необходимо почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, случайного эпителии и микрофлоры ротовой полости
•   выделившуюся мокроту собирают в стерильный контейнер. Если мокрота отделяется плохо, накануне пациенту дают отхаркивающие средства

ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ КРОВИ

*  натощак или через 3 часа после приема пищи в одноразовую пробирку с ЭДТА. После взятия кровь тщательно и аккуратно перемешать.

Транспортные среды представляют собой водно-солевые растворы, максимально адаптированные для хранения и траспортировки клинического материала.

Траспортная среда с муколитиком содержит ряд компонентов, повышающих эффективность экстракции ДНК из сложного клинического материал

•   Муколитик. Клинический материал, может содержать слизь разной консистенции и вязкости.Для повышения эффективности дальнейшейипробоподготовки добавляется муколитик, облегчающий растворение слизи и высвобождение микроорганизмов и вирусов, что обеспечивает стандартизацию процедуры экстракции при количественных ПЦР-исследованиях.
•   Консервант. Препятствует бактериальному проросту.
•   Стабилизатор. Препятствует клеточной деградации и обеспечивает возможность длительного хранения клинического материала при комнатной температуре.

РАСШИФРОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ

•   отрицательный результат указывает на то, что в исследуемом образце на момент сдачи биологического материала следов инфекционного агента не обнаружено
•   положительный результат указывает на наличие следов инфекции в исследуемом образце на данный момент. Результат может быть положительным, а об активной инфекции говорить нельзя – «здоровое носительство» - не требует лечения, но требует динамического наблюдения

Заведующий ЦДЛ 

Новополоцкой городской больницы

Маник Е.И.