Уменьшить шрифт Сбросить шрифт Увеличить шрифт

rubeen
rubeen

Современные методы лабораторной диагностики сепсиса.

Сепсис является тяжелым осложнением многих заболеваний, особенно у иммуносупрессирован-ных пациентов, в частности больных гемобластозами . Даже в развитых странах смертность от сепсиса очень велика. В США регистрируется около 750 тыс. случаев бактериального или грибкового сепсиса, из которых 215 тыс. заканчиваются летально. Высокая частота сепсиса отмечена также и в Европе: в Германии сепсис является третьей по частоте причиной смерти. История изучения сепсиса насчитывает много столетий. Само слово «сепсис» восходит к Гиппо-крату и в переводе с древнегреческого означает «гниение». Как медицинский термин был использован Гиппократом, откуда и перешел в другие языки. В ходе многолетнего изучения патогенеза сепсиса предложена масса определений: заражение крови, септическое состояние и т. д. Это создало терминологическую путаницу, которая затрудняет изучение данной проблемы. Значительный прогресс в терминологии был достигнут в 1992 году, когда насогласительной конференции Американской ассоциации пульмонологов и Общества интенсивной терапии был введен термин «синдром системной воспалительной реакции» (ССВР). Под ССВР понимается неспецифическая реакция на воздействие различных агрессивных факторов, таких как ишемия, воспаление, травма, инфекция. ССВР характеризуется двумя или более из следующих признаков: – количество лейкоцитов более 12 000кл/мм3 или менее 4 000 кл/мм3, или более 10% незрелых форм; – температура тела выше 38 °С или ниже 36 °С; – пульс более 90 уд/мин.; – частота дыхания более 20/мин.; – парциальное давление СО2 менее 32 мм рт. ст. Сепсис, таким образом, попал в одну из форм ССВР на инвазию микроорганизмами при наличии очага инфекции, а также двух или более признаков ССВР. Отдельно выделяют «тяжелый сепсис», который характеризуется органной дисфункцией, нарушением тканевой перфузии и гипотензией, и «септический шок» – тяжелый сепсис с тканевой и органной гипоперфузией, гипотензией, не поддающийся адекватной инфузионной терапии. Несмотря на большое число исследований, посвященных данной проблеме, во многих вопросах изучения патогенеза сепсиса нет ясности. В первую очередь необходимо пояснить значение известных терминов «бактериемия» и «сепсис», которые часто используются в различных и порой противоположных значениях. Бактериемия характеризуется обнаружением микробов в крови и не всегда является патологическим процессом. Транзиторные формы бактериемии, продолжительностью от нескольких минут до нескольких часов, связаны с колонизацией крови нормальной микробиотой. Появление бактерий в крови наблюдается после удаления зубов, чистки зубов и даже жевании пищи при периодонтозе. Ранее специфическое лечение сепсиса у больных гемобластозами рекомендовали начинать только после выявления возбудителя и установления его чувствительности к антибиотикам. С начала 80-х годов прошлого столетия стратегия лечения сепсиса у больных основывается на быстром применении эмпирической антибиотикотерапии. Одновременно у пациента берется кровь на бактериальный посев. Это позволило снизить летальность при данном тяжелом осложнении в 7 раз. Ответ бакте-риологической лаборатории может быть получен только через 24–72 ч и может лишь подтвердить инфекционную этиологию и идентифицировать возбудителя. Таким образом, роль бактериологической лаборатории в первый критический период возникновения сепсиса невелика, и успех лечения полностью определяется правильностью проводимой эмпирической антибиотикотерапии. В случае неэффективности проводимой эмпирической терапии критическое значение приобретает быстрая корректировка лечения, так как каждый час ее задержки повышает вероятность летального исхода на 5–8%. В этот период выявление возбудителя и определение его чувствительности к антибиотикам приобретает решающее значение. Целью данного обзора является анализ существующих и разрабатываемых методов лабораторной диагностики сепсиса. В настоящее время культуральный метод является основным способом этиологической диагно-стики. Рекомендуется проводить забор крови 2–3 раза в количестве 20–30 мл. При меньшем объеме забираемой крови частота выявлении возбудителей существенно снижается. При культивировании крови широко используются автоматические системы, такие как BacT/ALERT (BioMerieux) и Bactec 9240 (BectonDickinson). Обе системы основаны на регистрации количества СО2, выделяемого бактериями в процессе жизнедеятельности. Разработан широкий спектр сред для анаэробного и аэробного культивирования. Благодаря наличию добавки сорбента антибиотиков во флаконе возможен анализ образцов, полученных от пациентов при проведении антибиотикотерапии. Также нет необходимости в использовании отдельных флаконов для грибов. Определение грибов проходит во флаконах для аэробов. Однако срок культивирования посевов составляет 7 суток, и результат микробиологического анализа может быть получен самое раннее через 24–48 часов. Кроме того, микробиологический метод малоприменим для культивирования ряда микроорганизмов, таких как микоплазмы, нокардии, риккетсии, хламидии и др. Некоторые из этих микроорганизмов ответственны за развитие инфекционных эндокардитов, этиологическая диагностика которых очень важна для проведения целенаправленной этиотропной терапии. Поэтому в настоящее время для их диагностики используются серологические и молекулярно-биологические методы. В связи с этим понятен интерес к разработке альтернативных чувствительных и быстрых методов диагностики сепсиса и оценки его тяжести. К таким тестам относится, в частности, определениебиомаркеров сепсиса. В настоящее время известно около 200 биомаркеров сепсиса. Однако только немногие из нихнаходят клиническое применение. Это, в первую очередь, «белок острой фазы» – С-реактивный протеин. Широко используется определение про­кальцитонина (ПКТ). Прокальцитонин – предшественник гормона паращитовидной железы кальцитонина, регулирующего уровень кальция в крови. Показано, что уровень ПКТ коррелирует со степенью поражения органов при сепсисе и является важным прогностическим параметром. В плане этиологической диагностики следует отметить, что уровень ПКТ не изменяется при вирусных инфекциях, в частности при инфекции, вызванной вирусом гриппа, и значительно повышается при тяжелом течении бактериального сепсиса. Другая большая группа методов диагностики сепсиса основана на использовании технологии нуклеиновых кислот (NAT-технологий). Данное направление интенсивно разрабатывается в насто-ящее время. Уже более 20 лет NAT-технологии активно используются для индикации вирусов и трудно культивируемых микробов, таких как микоплазмы, уреаплазмы, хламидии и др. В то же время разработка молекулярно-биологических технологий выявления бактерий в кровяном русле связана с большими методическими проблемами, которые будут рассмотрены ниже. Для индикации бактерий в крови используют выявление участка генома, общего для всех бактерий (чаще всего 16S РНК), с помощью ПЦР. В дальнейшем в полученном амплификоне выявляют участки, специфичные для определенных групп бактерий. Например, разработана методика на основе ПЦР «в реальном времени» для молекулярно-биологической индикации бактерий и опре- деления их грампринадлежности в различных биоматериалах. Методика может быть использована, в частности, для определения бактериальной контаминации тромбоцитарной взвеси. Показано, что метод позволяет определять микробную контаминацию при содержании бактерий 101–102 КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл. В ряде случаев, например, при бактериальном контроле тромбоцитарной взвеси, этого достаточно для выбраковкиконтаминированных образцов. Кроме того, определение грампринадлежности выделенных бактерий имеет важное значение при исследовании крови у больных при сепсисе, так как течение и прогноз инфекций, вызванных грамположительными и грамотрицательными бактериями, различен. Метод ПЦР «в реальном времени» используется также для групповой и видовой идентификации бактерий, выявленных в крови. Кроме того, этот метод позволяет оценивать количество микробов в исследуемом материале. Это особенноважно для выявления роли контаминации крови малопатогенными микроорганизмами, такими как зеленящий стрептококк и эпидермальный  стафилококк, у онкогематологических больных с иммуносупрессией. Перспективным направлением использования NAT-технологий может быть их применение для мониторинга антибиотикорезистентности микроорганизмов. Известно, что внедрение в практику определенных стратегий эмпирической антибиотикотерапии существенным образом способно влиять на эпидемиологию резистентности возбудителей инфекций. Это особенно важно и на фоне недостаточного прогресса в области разработки и внедрения новых антимикробных препаратов. Использование молекулярно-биологических методов выявления генов антибиотикорезистентности (таких как ген mecA у стафилококков или ген van у энтерококков) позволяет на 12–16 часов сократить время определения чувствительности к антибиотикам по сравнению с обычными микробиологическими методами. Однако требуются дополнительные исследования для установления корреляции NAT-тестов и фенотипической устойчивости к антибиотикам. Большое число потенциальных возбудителей сепсиса, конечно, ограничивает возможности их видовой идентификации с помощью ПЦР. К настоящему времени разработаны наборы только для выявления основных возможных возбудителей. Однако даже эти наборы первого поколения нашли практическое применение. Накоплен определенный опыт их использования в ряде стран Европы, в том числе и в России. В настоящее время имеются два подхода к применению NАТ-методов для диагностики сепсиса: – использование ПЦР для быстрой видовой идентификации микроорганизмов, выявленныхмикробиологически (после автоматического культивирования); – прямое выявление нуклеиновых кислот бактерий и грибов непосредственно из биоматериала. Однако использование обоих подходов связано с необходимостью выделения ДНК бактерий из исследуемого материала. В идеале метод выделения должен быть автоматизированным и в то же время быть недорогим и применимым для выделения как бактериальной, так и грибковой ДНК. Основные трудности, которые необходимо преодолеть, связаны с присутствием ингибиторов ПЦР в исследуемом материале, возможной контаминации используемых реагентов бактериальной и грибковой ДНК и риском контаминации во время самой процедуры экстракции. Кроме того, следует учитывать,что в образцах преобладает ДНК форменных элементов крови и содержатся только следовые коли-чества бактериальной ДНК. Разрабатываются также методы выделения ДНК непосредственно из биоматериалов – образцов цельной крови, плазмы и сыворотки. Экстракция из образцов цельной крови, обработанной ЭДТА, позволяет получить большее количество бактерий, чем при выделении из сыворотки или плазмы. Однако присутствие ингибиторов ПЦР в цельной крови снижает чувствительность этого метода. Показана более высокая чувствительность образцов сыворотки для диагностики бруцеллеза, несмотря на то, что представители рода Brucella являют-ся факультативными внутриклеточными паразитами. Это говорит о необходимости выбирать протокол экстракции при разработке стандартной процедуры выделения. Существуют автоматизированные системы прямой экстракции ДНК из цельной крови. Однако их высокая стоимость ограничивает использование в практических лабораториях. Разрабатываются и другие, неамплификационные, методы идентификации микробов. Наиболее перспективными, по нашему мнению, являются протеомные технологии с использованием времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS). Этот метод позволяет идентифицировать бактерии и грибы по их белковому профилю. Также он позволяет определять некоторые маркеры антибиотикорезистентности. Основным недостатком данной технологии является невоз-можность ее применения непосредственно для биологических образцов. Здесь требуется предвари- тельное культивирование образцов для увеличения числа микробных тел в пробе. Кроме того, ввиду большой стоимости оборудования этот метод является недоступным для многих лабораторий. Как было сказано выше, имеется ряд коммерчески доступных наборов для определения инфекционных агентов в крови не микробиологическими методами. Ряд методов используется для идентификации микробов в положительных микробиологических пробах. Наиболее изученным из не микробиологических тестов является PNA-FISH (AdvanDX, США). Метод основан на гибридизации insitu флуоресцентно меченных пептидно-нуклеотидных проб к ограниченному набору бактерий. Метод удобен для использования, и анализ может быть выполнен за 3 часа. Заявленная фирмой чувствительность и специфичность метода близка к 99–100%. В наборе HyplexBloodScreen (BAG, Германия) используется мультиплексная ПЦР. Возможнаидентификация нескольких бактериальных видов, включая метициллиночувствительные и метициллинорезистентные штаммы стафилококков, стрептококков и энтерококков, а также гра-мотрицательных бактерий (E. coli, Enterobacteraerogenes, Pseudomonasaeruginosa, Klebsiellaspp.). Продолжительность проведения исследования 3–4 часа при заявленной чувствительности в дифференцировке различных видов от 96,6 до 100% и специфичности от 92,5 до 100%. Метод позволяет определять маркеры резистентности – гены van и несколько генов β-лактамаз. Недавно предложен набор с использованием метода микрочипов для определения большого количества видов бактерий и гена mecA (Mobidiag, Финляндия). Анализ занимает 3 часа с заявленной чувствительностью 94% и специфичностью 96%. Разрабатываются также методы по индикации микробов непосредственно из крови. Набор SepsiTest (Molzym, Германия) представляет собой метод, основанный на выявлении генов 16S рРНК бактерий и генов 18S рРНК грибов. Потенциально этот метод позволяет провести полную видовую дифференцировку бактерий и гри-бов с помощью секвенирования генома. Однако имеется большой риск контаминирования пробы на постамплификационном этапе исследований и получения ложноположительных результатов. Кроме того, секвенирование для его проведения требует 8–12 часов, что не позволяет рассматривать его как метод ранней диагностики сепсиса. Набор Vyoo(SIRS Lab, Германия) предствляет собой метод, основанный на мультиплексной ПЦР, позволяющий выявлять 35 видов бактерий, а также ряд генов антибиотикорезистентности (гены β-лактамаз, а также гены vanА, vanВ и mecA). Общее время проведения анализа – 8 часов при заявленной чувствительности 3–10 КОЕ/мл. Набор LightCyclerSeptiFastTest (RocheMolecularSystems, США), представляет собой тест-систему в формате мультиплексной ПЦР «в реальном времени» для диагностики сепсиса. Тест- система позволяет идентифицировать около 25 видов бактерий и грибов – возбудителей нозокомиальных септицемий. Таким образом, в настоящее время на рынке представлен ряд методов не бактериологической диагностики, основанных, в частности, на ПЦР «в реальном времени», использование которой значительно снижает риск контаминации. Наряду с методическими трудностями их внедрения необходимо также учитывать стоимость проведения анализав сравнении с общепринятыми методами. На современном этапе исследований для лабораторной диагностики сепсиса возможно применение комплекса микробиологических и молекулярно-биологических методов. Дальнейшее совершенствование NAT-технологий диагностики позволит внедрить их в работу практических микробиологических лабораторий. Результаты работ, проведенных в последние годы, показали, что NAT-методы, по крайней мере, так же чувствительны, как и микробиологические. Они позволяют определять и идентифицировать в крови трудно культивируемые и даже не растущие на обычных средах бакте-рии и грибы. Определение генов антибиотикорезистентности позволяет получать быструю информацию о чувствительности инфекционных агентов к антибиотикам. Однако требуются дополнительные исследования для установления корреляции NAT- тестов и фенотипической устойчивости к антибиотикам. На сегодняшний день, наряду с методологическими трудностями, главным препятствием внедрения NAT технологий является их высокая стоимость, однако развитие и совершенствование этих методов, безусловно, позволит удешевить их проведение и ввести NAT-тестирование в алгоритм диагностики сепсиса.

                                                                                                                          Врач лабораторной

диагностики ЦДЛ

    городской больницы 

                                                                                                                                         Л.И. Быкова